Doplňkový systém je komplexní komplex sérových globulinů. Tento kaskádový systém proteolytických enzymů je určen k humorální ochraně organismu před působením cizích agens a podílí se na realizaci imunitní odpovědi organismu. Proteiny komplementárního systému poskytují rychlou a účinnou reakci na zpočátku slabý signál a přivádějí jej do funkčních důsledků. Komponenty komplementového systému jsou obvykle označeny s latinskými písmeny.
Existují dva mechanismy pro aktivaci komplementového systému:
klasický;
alternativní.
Tyto mechanismy se zapojují na úrovni 5. složky a dále postupují stejným způsobem.
Klasickým způsobem.
Spouštěcím mechanismem je tvorba komplexu antigen-protilátka (AG-AT) na povrchu cílové buňky. Současně dochází ke konformačním změnám v molekule imunoglobulinu (označuje se: Ig nebo AT). V důsledku těchto změn získává Ig schopnost vázat C 1 q složku komplementu. C 1 r a C 1 s se k nim připojují a celý tento komplex prochází konformačním přeskupením a mění se na C 1 esterázu, která působí na C 4, C 4 a je štěpen a C 4 b je součástí komplexu. Poté se C2 spojí s komplexem a vytvoří nový substrát pro působení C1s, C2b se odštěpí a C2a se stane součástí komplexu.
Výsledný komplex se nazývá „C3-konvertáza“ a jeho působením se štěpí peptid C3a a C3b je součástí komplexu, který se nyní nazývá „C5-konvertáza“. C5 konvertáza působí na C5, štěpí z něj C5a a C5b je součástí komplexu.
Poté jsou C6, C7 a C8 postupně asociovány s C5b. Výsledkem je vytvoření komplexu, který je schopen připojit 2 molekuly C9.
Pokud k tomuto procesu dochází na povrchu cílové buňky, pak složky komplexu C 5 b-C 9 tvoří membránový atakující komplex, který tvoří transmembránové kanály na povrchu cílové buňky, které jsou zcela propustné pro elektrolyty a vodu. Cílová buňka umírá.
Vedlejší produkty (minority) procesu C 3 a a C 5 a mají vlastnosti anafylotoxinů.
Regulace klasické dráhy.
Většina komponent je aktivních pouze jako součást komplexu. Jejich aktivní formy mohou existovat velmi krátkou dobu. Pokud se během této doby nesetkají s další složkou, pak aktivní formy ztratí kontakt s komplexem a stanou se neaktivními. Pokud je koncentrace jakékoli složky pod prahovou hodnotou (kritická), pak činnost systému komplementu nepovede k fyziologickým následkům.
Na regulaci komplementového systému se podílejí i endogenní inhibitory proteináz. Nejúčinnější z nich je C 1 inhibitor.
Alternativní způsob.
Rozdíl mezi alternativní cestou a klasickou je v tom, že ke spuštění nevyžaduje tvorbu imunitních komplexů.
Spouštěcím mechanismem alternativní dráhy je tvorba C 3 b z C 3 pod vlivem nějakého spouštěcího faktoru: např. polysacharidů bakteriální buněčné stěny.
C3b tvoří komplex s faktorem „B“ (C 3 bB), který je vystaven proteáze D (vždy aktivní v krevní plazmě!). V důsledku toho se odštěpí „Ba“ a vznikne komplex C3bBb, který má proteolytickou aktivitu vůči C5 – štěpí z něj C5a.
Poté reakce probíhají stejně jako klasickým způsobem.
Substrátem pro C 3 b je také C 3, v důsledku čehož vzniká ještě větší množství C 3 b - je pozorována pozitivní zpětná vazba. Proto i malá množství C 3 bBb stačí k získání stále většího množství jeho aktivní formy (zesílení původně slabého signálu).
Alternativní cesta normálně funguje vždy a velmi aktivně, což poskytuje rychlou nespecifickou odpověď na vnesení cizích buněk.
Na regulaci komplementového systému se podílejí specifické inhibitory, které regulují rychlost enzymů klíčových reakcí.
Žádné regulační mechanismy v mnoha fázích by byl systém komplementu neúčinný; neomezená konzumace jeho složek by mohla vést k vážnému, potenciálně smrtelnému poškození buněk a tkání těla. V prvním kroku inhibitor C1 blokuje enzymatickou aktivitu Clr a Cls a následně štěpení C4 a C2. Aktivovaný C2 přetrvává pouze krátkou dobu a jeho relativní nestabilita omezuje životnost C42 a C423. Enzym aktivující alternativní dráhu C3, C3bBb, má také krátký poločas, ačkoli vazba properdinu na enzymový komplex prodlužuje životnost komplexu.
V sérum existuje inaktivátor anafylatoxinu - enzym, který štěpí N-terminální arginin z C4a, C3a a C5a a tím prudce snižuje jejich biologickou aktivitu. Faktor I inaktivuje C4b a C3b, faktor H urychluje inaktivaci C3b faktorem I a podobný faktor, protein vázající C4 (C4-bp), urychluje štěpení C4b faktorem I. Tři konstituční proteiny buněčných membrán - PK1 , membránový kofaktorový protein a urychlující rozpad faktoru (FUR) - ničí komplexy C3- a C5-konvertázy, které se tvoří na těchto membránách.
jiný komponenty buněčné membrány- asociované proteiny (mezi nimiž je nejvíce studován CD59) - mohou vázat C8 nebo C8 a C9, což zabraňuje integraci komplexu atakujícího membránu (C5b6789). Některé proteiny krevního séra (mezi nimiž jsou nejvíce prozkoumané protein S a klusterin) blokují připojení komplexu C5b67 na buněčnou membránu, jeho vazbu na C8 nebo C9 (tj. vytvoření plnohodnotného komplexu pro útok na membránu) nebo jinak. zabránit vzniku a integraci tohoto komplexu.
Ochranná role komplementu
Neutralizace viry protilátky jsou zesíleny C1 a C4 a zvyšují se ještě více po fixaci C3b, která se tvoří podél klasické nebo alternativní dráhy. Doplněk se tak stává obzvláště důležitým v raná stadia virová infekce kdy je počet protilátek stále malý. Protilátky a komplement omezují infekčnost alespoň některých virů a díky tvorbě typických „otvorů“ komplementu viditelných pod elektronovou mikroskopií. Interakce Clq s jeho receptorem opsonizuje cíl, tj. usnadňuje jeho fagocytózu.
C4a, C3a a C5a jsou fixovány žírnými buňkami, které začnou vylučovat histamin a další mediátory, což vede k vazodilataci a edému a hyperémii charakteristické pro zánět. Pod vlivem C5a monocyty vylučují TNF a IL-1, které zesilují zánětlivou odpověď. C5a je hlavním chemotaktickým faktorem pro neutrofily, monocyty a eozinofily, schopný fagocytovat mikroorganismy opsonizované C3b nebo jeho štěpným produktem iC3b. Další inaktivace buněčně vázaného C3b, která vede ke vzniku C3d, jej zbavuje opsonizační aktivity, ale jeho schopnost vázat se na B lymfocyty je zachována. Fixace C3b na cílové buňce usnadňuje její lýzu NK buňkami nebo makrofágy.
Vazba C3b s nerozpustnými imunitními komplexy je solubilizuje, protože C3b zjevně ničí mřížkovou strukturu komplexu antigen-protilátka. Současně je možné, aby tento komplex interagoval s receptorem C3b (PK1) na erytrocytech, které transportují komplex do jater nebo sleziny, kde je absorbován makrofágy. Tento jev částečně vysvětluje vývoj sérová nemoc(imunitní komplexní onemocnění) u osob s deficitem C1, C4, C2 nebo C3.
26.1. Obecná koncepce
Komplement je komplexní proteinový komplex krevního séra.
Odpověď: Systém komplementu se skládá z 30 proteinů (složek nebo frakcí systému komplementu).
B. Systém komplementu je aktivován v důsledku kaskádového procesu: produkt předchozí reakce působí jako katalyzátor pro následující reakci. Navíc, když je aktivován zlomek složky, dochází k jejímu štěpení v prvních pěti složkách. Produkty tohoto štěpení jsou označovány jako aktivní frakce komplementového systému.
1. Největší z fragmentů (označuje se písmenem b), vzniklý při štěpení neaktivní frakce, zůstává na povrchu buňky - k aktivaci komplementu dochází vždy na povrchu mikrobiální buňky, nikoli však na povrchu eukaryotických buněk . Tento fragment získává vlastnosti enzymu a schopnost ovlivňovat následnou složku a aktivovat ji.
2. Menší fragment (označený písmenem a) je rozpustný a „přechází“ do kapalné fáze, tzn. do krevního séra.
B. Frakce komplementového systému jsou označeny odlišně.
1. Devět – nejprve otevřít– proteiny komplementového systému jsou označeny písmenem C (od anglické slovo doplněk) s odpovídajícím číslem.
2. Zbývající frakce komplementového systému jsou označeny jinými latinskými písmeny nebo jejich kombinacemi.
D. Význam komplementu pro makroorganismus je velký a rozmanitý (více podrobností viz část 26.6).
1. Některé z aktivních frakcí systému komplementu jsou proteázy.
2. Některé se vážou na komplex antigen-protilátka (imunitní komplex).
3. Jiné aktivují žírné buňky a související vaskulární zánětlivé reakce.
4. A nakonec část komplementových frakcí perforuje membrány bakteriálních buněk.
26.2. Doplňte aktivační cesty
Existují tři cesty aktivace komplementu: klasická, lektinová a alternativní.
A. Klasická cesta aktivace komplementu je hlavní. Účast na této dráze aktivace komplementu je hlavní funkcí protilátek.
Obrázek 26.2-2. Schéma klasické dráhy aktivace komplementu
1. Aktivaci komplementu podél klasické dráhy spouští imunitní komplex: komplex antigenu s imunoglobulinem (třída G - první tři podtřídy - nebo M). Místo protilátky může „obsadit“ C-reaktivní protein – takový komplex také aktivuje komplement po klasické dráze.
2. Klasická cesta aktivace komplementu probíhá následovně (obrázek 26.2-1).
A. Nejprve se aktivuje frakce C1: skládá se ze tří podfrakcí (C1q, C1r, C1s) a převádí se na enzym C1-esterázu (C1qrs).
b. C1-esteráza štěpí frakci C4.
PROTI. Aktivní frakce C4b se kovalentně váže na povrch mikrobiálních buněk (nikoli však na vlastní eukaryotické buňky mikroorganismu) a zde k sobě přidává frakci C2.
d. Frakce C2 v kombinaci s frakcí C4b je štěpena C1-esterázou za vzniku aktivní frakce C2b.
e. Aktivní frakce C4b a C2b do jednoho komplexu – C4bC2b – který má enzymatickou aktivitu. Jedná se o tzv. C3 konvertázu klasické dráhy.
e. C3 konvertáza štěpí C3 frakci za vzniku velkého množství aktivní C3b frakce.
a. Aktivní frakce C3b se spojí s komplexem C4bC2b a převede jej na C5 konvertázu (C4bC2bC3b).
h. C5 konvertáza štěpí frakci C5.
A. Výsledná aktivní frakce C5b se spojí s frakcí C6.
j. Komplex C5bC6 spojuje frakci C7.
l. Komplex C5bC6C7 je integrován do fosfolipidové dvojvrstvy mikrobiální buněčné membrány.
K tomuto komplexu je připojen protein C8.
n. Protein C8, který je spolu s celým komplexem ve fosfolipidové dvojvrstvě membrány mikrobiálních buněk, katalyzuje polymeraci 10 - 16 molekul proteinu C9. Tento polymer vytváří v mikrobiální buněčné membráně nekolabující pór o průměru asi 10 nm (obrázek 26.2-2), což vede k lýze mikrobu (protože na jeho povrchu se tvoří mnoho takových pórů – „aktivita“ jedné jednotky C3 konvertázy vede ke vzniku asi 1000 por). Komplex C5bC6C7C8C9 vytvořený jako výsledek aktivace komplementu se nazývá komplex membránového útoku (MAC).
Rýže. 26,2-2. Schéma vzniku MAC (vlevo) a výsledek aktivace komplementu - tvorba póru ve fosfolipidové dvojvrstvě mikrobiální membrány, vedoucí k osmotické lýze mikrobiální buňky (vpravo)
Obrázek 26.2-3. Schéma lektinové dráhy aktivace komplementu
B. Lektinová dráha aktivace komplementu je spouštěna komplexem normálního krevního sérového proteinu - lektinu vázajícího manan (MBL) - se sacharidy povrchových struktur mikrobiálních buněk (se zbytky manózy). Serinová proteáza asociovaná s MSL, aktivovaná v důsledku tohoto procesu, působí podobně jako C1-esteráza klasické dráhy, podél které se ve skutečnosti vyvíjejí další děje končící vznikem MAC (obr. 26.2-3). .
B. Alternativní cesta pro aktivaci komplementu (obr. 26.2-4) začíná kovalentní vazbou aktivní frakce C3b - která je vždy přítomna v krevním séru v důsledku spontánního štěpení frakce C3, ke kterému zde neustále dochází - s povrchové molekuly ne všech, ale některých mikroorganismů.
Rýže. 26.2-4. Schéma alternativní dráhy aktivace komplementu
1. Další události se vyvíjejí následovně.
A. C3b váže faktor B (který je strukturně a funkčně homologní s faktorem C2) a vytváří komplex C3bB.
b. Po navázání na C3b působí faktor B jako substrát pro faktor D (sérová serinová proteáza), který jej štěpí za vzniku aktivního komplexu C3bBb. Tento komplex má enzymatickou aktivitu, je strukturně a funkčně homologní s C3 konvertázou klasické dráhy (C4bC2b) a nazývá se C3 konvertáza alternativní dráhy.
PROTI. Samotná alternativní dráha C3 konvertázy je nestabilní. Aby alternativní cesta aktivace komplementu úspěšně pokračovala, je tento enzym stabilizován faktorem P (properdin).
d. Co se stane dále, je podobné klasické cestě aktivace komplementu.
1. Produkuje se mnoho C3b a vzniká komplex C3bBbC3b, což je C5 konvertáza.
2. Aktivace C5 vede k vytvoření komplexu atakujícího membránu (viz sekce 26.2.A.2.i - 26.2.A.2.n).
2. Hlavním funkčním rozdílem mezi alternativní cestou aktivace komplementu ve srovnání s klasickou je rychlost odpovědi na patogen: protože nevyžaduje čas na akumulaci specifických protilátek a tvorbu imunitních komplexů.
D. Je důležité pochopit, že jak klasická, tak alternativní cesta aktivace komplementu působí paralelně a také se vzájemně zesilují (tj. posilují). Jinými slovy, komplement není aktivován „buď klasickými nebo alternativními“ cestami, ale „klasickými i alternativními“ aktivačními cestami. To je s přidáním dráhy aktivace lektinu jeden proces (viz obr. 26.2-5), jehož různé složky se mohou jednoduše projevit v různé míře.
26.3. Anafylotoxiny
Aktivní frakce komplementu C3a a C5a se nazývají anafylotoxiny, protože se podílejí mimo jiné na alergická reakce nazývané anafylaxe (viz níže). Nejúčinnějším anafylotoxinem je C5a.
A. Anafylotoxiny působí na různé buňky a tkání makroorganismu.
1. Jejich účinek na žírné buňky způsobuje degranulaci žírných buněk.
2. Anafylotoxiny působí také na hladké svaly a způsobují jejich kontrakci.
3. Působí také na cévní stěnu: způsobují aktivaci endotelu a zvyšují jeho permeabilitu, což vytváří podmínky pro extravazaci tekutiny a krvinek z cévního řečiště při rozvoji zánětlivé reakce.
B. Anafylotoxiny jsou navíc imunomodulátory, tzn. působí jako regulátory imunitní odpovědi.
1. C3a působí jako imunosupresor (tj. potlačuje imunitní odpověď).
2. C5a je imunostimulant (tj. zesiluje imunitní odpověď).
26.2-4. Obecné schéma aktivace komplementu
26.2-5. Diagram ilustrující vztah cest aktivace komplementu
26.4. Receptory pro složky komplementu
Frakce komplementu mohou ovlivnit buňky makroorganismu pouze v případě, že makroorganismus má odpovídající receptory.
A. Fagocyty mají receptor pro C3b. Tento receptor způsobuje větší aktivitu fagocytů ve vztahu k opsonizovaným mikrobům (zejména těm z nich, na jejichž povrchu je přítomna frakce C3b).
B. Červené krvinky mají specifické receptory pro frakce C3b a C4b. S těmito receptory váží erytrocyty odpovídající frakce komplementu ve složení cirkulujících imunitních komplexů (CIC) a transportují tyto komplexy do makrofágů sleziny a jater, které je zničí, a tím vyčistí (tj. očistí) krev od CIC.
B. Na žírných buňkách jsou lokalizovány receptory pro frakci C5a, jejichž prostřednictvím tento anafylatoxin tyto buňky aktivuje a způsobuje jejich degranulaci.
D. Makrofágy mají stejný receptor, díky kterému frakce C5a tyto buňky aktivuje.
26.5. Regulace komplementového systému
Normálně, v nepřítomnosti patogenu ve vnitřním prostředí makroorganismu, je úroveň spontánní aktivity systému komplementu nízká. Kaskádový mechanismus aktivace komplementu je „spouštěn“ aktivátory a regulace jeho práce je „spouštěna“ zpětná vazba» – inhibitory, bez kterých by každá epizoda aktivace skončila úplným vyčerpáním celého systému.
A. Aktivátory systému komplementu jsou molekulární komplexy umístěné na povrchu mikroorganismu a spouštějí proces aktivace komplementu podél jedné či druhé cesty. Již byly zmíněny výše (viz část 26.2).
1. Dva komplexy působí jako aktivátory klasické dráhy aktivace komplementu.
A. Imunitní komplex (komplex antigen-protilátka).
b. Komplex antigenu s C-reaktivním proteinem.
2. Aktivátorem lektinové dráhy aktivace komplementu je komplex normálního krevního sérového proteinu - lektinu vázajícího manan (MBL) - se sacharidy povrchových struktur mikrobiálních buněk (zejména se zbytky manózy).
3. Dva komplexy působí jako aktivátory alternativní dráhy aktivace komplementu.
A. Komplex (jako výsledek kovalentní vazby) aktivní frakce C3b - která je vždy přítomna v krevním séru v důsledku spontánního štěpení frakce C3, ke které zde neustále dochází - s povrchovými molekulami ne všech, ale některých mikroorganismy.
b. Imunoglobuliny tříd A a E agregované na povrchu mikroba.
B. Inhibitory komplementového systému jsou lokalizovány v krevním séru nebo na buněčné membráně.
1. V krevním séru je lokalizováno pět proteinů – inhibitorů systému komplementu.
A. C1 inhibitor (C1inh) inaktivuje aktivní frakci C1qrs (tj. C1 esterázu).
b. Protein vázající C4 (C4BP) činí faktor C4b dostupným pro degradaci faktorem I.
PROTI. Faktor H – zpřístupňuje faktor C3b pro degradaci faktorem I.
d. Faktor I štěpí C3b (v komplexu s faktorem H) a C4b (v komplexu s C4BP).
e. Protein S se váže na komplex C5bC6C7 a zabraňuje další tvorbě komplexu atakujícího membránu.
2. Na savčích buňkách (a v souladu s tím na lidských buňkách) jsou lokalizovány tři proteiny, inhibitory systému komplementu.
A. DAF (decay-accelerating factor = faktor, který urychluje rozpad) inaktivuje C4bC2b (protože se váže na C4b místo na C2).
b. MCP (membránový kofaktor proteolýzy) zpřístupňuje faktor C3b pro degradaci faktorem I.
PROTI. Protektin (také označovaný jako molekula CD59) inaktivuje proteiny komplexu membránového útoku (zabraňuje lýze vlastních buněk zprostředkované C)
26.6. Funkce komplementového systému
Systém komplementu hraje velmi důležitou roli v ochraně makroorganismu před patogeny.
A. Systém komplementu se podílí na inaktivaci mikroorganismů, vč. zprostředkovává účinek protilátek na mikroby.
B. Aktivní frakce komplementového systému aktivují fagocytózu.
B. Aktivní frakce komplementového systému se účastní tvorby zánětlivé odpovědi.
26.7. Stanovení aktivity komplementového systému
Ke stanovení aktivity komplementu využívají moderní imunologické laboratoře hemolytickou reakci a ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), která nahradila Manciniho radiální imunodifúzní reakci.
A. Hemolytická reakce se používá ke stanovení titru komplementu a k měření celkové aktivity komplementového systému.
1. Titr komplementu je definován jako maximální ředění krevního séra, které způsobí lýzu ovčích červených krvinek naložených antierytrocytárními protilátkami (tzv. hemový systém).
2. Celková aktivita komplementového systému je chápána jako množství komplementu, které zajišťuje lýzu 50 % červených krvinek hemového systému (označuje se jako CH50).
B. Enzymová imunoanalýza se používá ke stanovení koncentrace jednotlivých složek komplementového systému v krevním séru (C1q, C1s, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, properdin, faktor B, inhibitor C1). Dříve se koncentrace funkčně nejvýznamnějších frakcí komplementového systému (obvykle C3 a C4) určovala pomocí Manciniho imunodifuzní reakce, ale v moderních laboratořích vybavených analyzátory ELISA se k tomuto účelu používá enzymová imunoanalýza, která výrazně rozšířila možnosti hodnocení funkčního stavu pacienta jeho komplementový systém.
A. Systém komplementu je zapojen do inaktivace mikroorganismů, vč. zprostředkovává účinek protilátek na mikroby.
B. Aktivní frakce systému komplementu aktivovat fagocytózu(opsoniny - C3b a C5b).
B. Aktivní frakce komplementového systému se účastní tvorba zánětlivé reakce.
Jejich účinek na žírné buňky způsobuje degranulaci žírných buněk.
Anafylotoxiny také působí na hladké svaly a způsobují jejich kontrakci.
Působí i na cévní stěnu: způsobují aktivaci endotelu a zvýšení jeho permeability, což vytváří podmínky pro extravazaci (výstup) tekutiny a krvinek z cévního řečiště při rozvoji zánětlivé reakce.
C3a působí jako imunosupresor (tj. potlačuje imunitní odpověď).
C5a je imunostimulant (tj. zesiluje imunitní odpověď).
Nazývá se komplex C5bC6C7C8C9 vytvořený jako výsledek aktivace komplementu membránový útočný komplex (MAC).
K provedení bakteriolýzy nebo cytolýzy je nutná aktivace složek komplementu z C3 na C9 klasickou nebo alternativní cestou. Velké fragmenty C3b a C4b působí jako opsoniny - adsorbované na povrchu buněk, zesilují fagocytární reakci a podporují imunitní adhezi komplexu Ag-AT-komplement na povrch imunokompetentních buněk (B-lymfocytů). Nízkomolekulární fragmentové polypeptidy - C3, C5a podporují uvolňování biogenních aminů (histamin, serotonin) z žírných buněk, způsobují kontrakci hladkého svalstva, zvyšují vaskulární permeabilitu, způsobují chemotaxi neutrofilů a monocytů do místa zánětu. Komponenty CI-C4 neutralizují některé viry. Syntéza proteinů komplementu je prováděna buňkami mononukleárního fagocytárního systému, fiblasty a játry. Lidé mají genetické defekty ve většině složek komplementu. Klinicky se projevují ve formě syndromu systémového lupus erythematodes, recidivujících pyogenních infekcí a angioedému.
Údaje o funkční aktivitě proteinů komplementu a jejich koncentracích poskytují velmi důležité informace o průběhu onemocnění a lze je využít k posouzení závažnosti průběhu, účinnosti terapeutických opatření a prognózy onemocnění.
Metody studia komplementového systému
I. Stanovení celkové hemolytické aktivity klasické dráhy. Krevní sérum se zředí fyziologickým roztokem v poměru 1:10 a přidá se do zkumavek v objemu 0,05 až. 0,5 ml. Objem vzorku se upraví na 1,5 ml fyziologickým roztokem a přidá se 1,5 ml hemolytického systému (směs stejných objemů 3% suspenzí ovčích erytrocytů a hemolytického séra). Zkumavky se inkubují při 37 °C po dobu 45 minut, ochladí se na 4 °C, aby se reakce zastavila, a odstřeďují se při 1500 otáčkách za minutu po dobu 4-5 minut. Po centrifugaci se stanoví objem séra, který způsobí lýzu 50 % senzibilizovaných erytrocytů (konvenční hemolytická jednotka aktivity komplementu - CH 50), poté se vypočítá množství CH 50 na ml celého séra. U zdravých lidí je titr komplementu (CH 50 na ml) přibližně 40-60 CH 50.
Zjišťuje se i hemolytická aktivita alternativní dráhy komplementu, ale místo senzibilizovaných ovčích erytrocytů se k blokování klasické aktivační dráhy používají nesenzibilizované králičí erytrocyty a fyziologický roztok obsahující Mg ionty, ale bez Ca.
2. Stanovení funkční aktivity jednotlivých složek. Tato metoda umožňuje stanovit počet funkčně aktivních molekul v 1 ml krevního séra. K tomu se ke senzibilizovaným erytrocytům přidá činidlo pro specifickou složku komplementu (jako činidlo se použije buď směs složek komplementu s výjimkou požadované, nebo krevní sérum bez aktivity této složky. Sérum pro titraci složky klasické dráhy se ředí 40-50krát a alternativa - 5-7krát Tímto způsobem je možné určit defekt určitých složek a určit profil komplementu u různých onemocnění.
3. Imunochemické stanovení koncentrace složek komplementu. Tato výzkumná metoda umožňuje určit koncentraci každého proteinu komplementu pomocí antisér (protilátek) proti nim. Koncentrace bílkovin je vyjádřena v g/l. Pro stanovení se používá metoda radiální imunodifuze u arape.
4 Stanovení aktivity komplementu a jeho složek radiální hemolýzou v agarovém gelu. Hemolytický systém se smíchá s roztaveným agarem v poměru 1:7 a rychle se nalije do sterilních Petriho misek. Po vytvrzení se v agaru udělají jamky o průměru 4 mm (až 15 jamek na 1 šálek). Jamky se naplní testovacím sérem a destičky se umístí na 21 hodin do chladničky při 4 °C, aby se umožnilo proteinům komplementu difundovat do agaru. Poté se kalíšky umístí na 60 minut do termostatu, aby se odhalily zóny hemolýzy. Kritériem pro aktivitu komplementu je druhá mocnina průměru hemolytických zón.
Doplněk a jeho aktivace
Poznámka 1
Doplněk- Tento komplexní systém proteiny, čítající přes 30, přítomné v cytoplazmě a na povrchu buněk.
Komplement je soubor enzymů, které jsou aktivovány různými specifickými podněty. V tomto případě se vytvoří rychlá, mnohonásobně zesílená odezva: primární signál spustí kaskádový proces, ve kterém produkt jedné reakce slouží jako enzym-katalyzátor pro reakci následující.
Komplement je důležitou součástí vrozeného imunitního systému, protože aktivované nebo degradované produkty mají řadu ochranných funkcí.
Mnoho komponent komplementu je označeno symbolem „C“ a číslem, které odpovídá chronologii jejich objevu.
Stručná charakteristika některých složek komplementového systému
V porovnání s ostatními složkami komplementu obsahuje tělo nejvíce složky C3, která plní nejdůležitější funkce.
Poznámka 2
V normální podmínky$C3$ protein je kontinuálně štěpen za vzniku funkčně podobné molekuly. Následně při interakci s dalšími složkami komplementu, faktorem B a za přítomnosti hořčíkových iontů vzniká nový protein, který má novou důležitou enzymatickou aktivitu – je to $C3$-konvertáza.
Štěpení $C3$ hraje důležitou roli při likvidaci patogenních mikrobů.
- v přítomnosti velkého množství mikroorganismů se objevuje aktivita $C3$-konvertázy;
- se tvoří velký počet$C3$ produkty štěpení;
- dochází k vazbě na povrch mikrobiálních buněk;
- vázaná konvertáza je ovlivněna proteinem properdinem, který podporuje její větší stabilizaci;
- Na povrchu mikrobiálních buněk se hromadí velké množství $C3b$ proteinu.
Komplement se aktivuje, když se mikrobiální povrchové sacharidy navážou na lektin vázající manózu (MBL), což je protein krevní plazmy.
- MSL se váže na zbytky manózy a další sacharidy, které tvoří bakteriální buňky;
- je zahájena řada reakcí, které vyvrcholí aktivací komplementu;
- MSL aktivuje komplement interakcí se serinovými proteázami;
- aktivace $C3$ iniciuje působení mechanismu pozitivní zpětné vazby a tvorbu komplexu lýzy membrány.
Reakce zahájené štěpením $C3$ vedou k vytvoření komplexu lyzujícího membránu.
- v důsledku řady transformací se vytvoří amfipatická molekula, která může proniknout lipidovou dvojvrstvou a polymerovat za vzniku komplexu lyzujícího membránu (MLC);
- LMC tvoří transmembránový kanál, který je zcela propustný pro vodu a elektrolyty;
- Vlivem vysokého intracelulárního tlaku a vstupu sodíkových iontů se voda dostává do buňky, což vede k lýze.
Během infekce je $C3$ konvertáza stabilizována a komplement je aktivován alternativní cestou:
Biologické funkce komplementu
Doplněk plní následující ochranné funkce:
- Složka $C3b$ váže receptory komplementu. Fagocytární buňky nesou receptory pro složky komplementu $C3b(CR1)$ a $C3bi(CR3)$, což usnadňuje připojení mikrobiálních buněk k fagocytům a následnou fagocytózu. Proces vazby $C3bc$ mikrobiálními buňkami se nazývá opsonizace.
Když je komplement aktivován, uvolňují se biologicky aktivní fragmenty. Při štěpení molekul $C3$ a $C5$ vznikají malé peptidy $C3a$ a $C5a$, které jsou anafylatoxiny a plní řadu důležitých funkcí:
- způsobit uvolnění ochranných mediátorů (histamin, tumor nekrotizující faktor, leukotrien $B4$ aj.;
- ovlivnit eozinofily, $C5a$ – neutrofily;
- stimulovat respirační aktivitu v buňkách;
- zvýšit expresi povrchových receptorů pro $C3b$;
- $5a$ – silné chemotaktické činidlo pro neutrofily;
- ovlivňují endotel kapilár, rozšiřují cévy a zvyšují jejich propustnost.
Komplex komplementu lyzující membránu poškozuje membránu.
- Komplement se účastní indukce tvorby protilátek. Receptor pro $C3b$ se podílí na regulaci aktivity $B$-buněk. Proliferace $B$ buněk a jejich syntéza protilátek závisí na aktivaci vyvolané vazbou antigenu na receptory buněčného povrchu. V přítomnosti $C3b$ se prahová koncentrace antigenu pro aktivaci buněk $B$ snižuje, takže jsou aktivovány s mnohem nižším obsahem antigenu v těle.